人诱导多能干细胞（hiPSCs）是疾病建模、再生医学的核心工具，但传统培养依赖Matrigel等动物源涂层，存在批次差异大、临床应用受限的问题；而人源重组蛋白筛选因传统高通量筛选（HTS）试剂消耗大、成本高难以推进[1]。dropletmicroarray（DMA）平台凭借超微量反应（200 nL/斑点）、低消耗（蛋白用量仅为96孔板的1/860）的优势，为解决这一难题提供了新思路。本研究通过DMA筛选231种人源蛋白组合，成功挖掘出可长期维持hiPSCs多能性的无动物源涂层，为hiPSCs临床转化与基础研究奠定基础。
实验方法
01、核心平台与材料设计
采用超疏水-亲水界面构建的DMA芯片（7.5×2.5cm，含672个1 mm×1 mm独立斑点，图1），选取11种人源蛋白（如EphB4、EpCAM、LN521等），设计单组分、55种二元组合及165种三元组合，共231组筛选体系，以Matrigel为阳性对照、无涂层为阴性对照。
图1. 筛选工作流程的示意图。打印：将60 nL的蛋白质溶液(每个蛋白质的最终浓度为10μg mL-1)打印到每个预定的点上，在RT下孵育2 h，然后加入细胞悬液。培养：hPSCs按200 nL/斑点的体积配制，培养24 h后IF染色检测NANOG的表达。图像分析：定量IF染色的平均荧光强度。圆圈的大小和颜色与免疫荧光法测定的NANOG的相对表达相对应：左下角对应Matrigel对照的表达，红色和小圆圈表示NANOG的表达低于Matrigel对照，绿色和大圆圈表示NANOG的表达高于Matrigel。初步的HTS包括11个单一蛋白、55个二元组合和165个三元组合，共231个筛选组。验证：选择HITS，并在长达五周的培养期间，通过对一组更大的多能性标记(转录因子：Nanog、SOX2、OCT-4A，细胞表面标记：SSEA4、TRA-1-81和TRA-1-60)的免疫荧光染色，在HiPSCs中进一步验证HIT。比例尺：50 μm。
02、关键操作与I.DOT应用
蛋白涂层制备：通过I.DOT非接触式纳升级移液系统将60 nL浓度为10μg/mL的蛋白溶液精准打印至DMA斑点，室温孵育2h实现涂层（图1流程第一步），全程维持70%湿度避免液滴蒸发，确保微量蛋白溶液的均一性与稳定性。
hiPSCs接种与培养：同样使用I.DOT打印200 nL hiPSCs悬液至蛋白涂层斑点（图1流程第二步），将DMA置于含湿润垫的培养皿中，37℃、5%CO培养24h（图1流程第二步）
03、关检测与验证流程
培养后通过免疫荧光染色检测多能性标志物 NANOG（图 1流程第三步），利用自动荧光显微镜成像并量化荧光强度（图 1流程第四步）；对初筛阳性组合进行5代长期培养，通过qPCR和免疫荧光验证多能性标志物（NANOG、SOX2等），并通过类胚体（EB）形成实验验证三胚层分化能力（图2A流程）。
图2. 通过分化成三个胚层来验证来自初步筛选的两个命中。A)HiPSCs分化为三个胚层的示意图。(B)在未分化集落(NC)和表面涂有MG、BIK(EphB4+DAG1+LN521)和GHK(EpCAM+BSG+LN521)的HiPSCs中，检测FOXA2(内胚层)、brachyury (中胚层)和-微管蛋白3(外胚层)的标记。比例尺：20 μm。
实验结果
01、DMA 平台可行性验证
hiPSCs在DMA上的存活与多能性：非接触纳升级移液系统I.DOT接种的hiPSCs活力达69.43%，显著高于手动接种的58.28%；细胞表达SOX2、OCT-4A、NANOG等多能性标志物，与微孔板培养结果一致（图 3A），且E-钙黏蛋白表达符合多能性特征（图 3E），证明DMA可维持hiPSCs特性。
实验质量保障：阳性（Matrigel）与阴性（无涂层）对照的NANOG荧光强度差异显著，Z'因子达0.64（图 3D），符合高质量HTS标准，确认筛选体系可靠。
图3.筛查方案的有效性。A)在涂有Matrigel的DMA玻片上200 nL液滴中培养的HiPSCs的典型共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像，并对六种多能性标志物进行染色：SOX2、OCT-4A、NANOG、TRA-1-60、SSEA4和TRA-1-81。三个独立的实验(n=3)获得了可比较的结果。用DAPI对细胞核进行反染。比例尺：50μm。b)阳性对照(Matrigel，MG+)和阴性对照(非Matrigel，MG-)培养的HiPSCs的亮视野图像。标尺：100μm. c)NANOG表达水平作为初步筛选的读数。如果在DMA上进行染色，然后进行自动显微镜观察。一张图片中的所有菌落都来自这一滴。比例尺：50μm.d)对培养在阳性和阴性对照上的HiPSCs的平均亮度(平均荧光强度)进行定量，并对多能性标记NANOG进行染色。平均荧光强度计算为总荧光强度除以面积(以像素为单位)。*P <0.001，阳性对照和阴性对照有显著差异。(Z′值介于0.5和1之间，对应于高质量的筛选试验)。数据以平均值±3SD表示。(n=3)E)阳性和阴性对照涂层培养的HiPSCs中E-钙粘蛋白表达的CLSM图像。E-钙粘附素介导细胞间的相互作用，并有助于干细胞克隆的形成和多能性。因此，在阳性对照涂层上，未分化的HiPSCs高表达E-cadherin，而在阴性对照涂层上，分化的HiPSCs显示低或不表达E-cadherin。用DAPI对细胞核进行反染。比例尺：25 μm。
02
初筛：10种高活性三元蛋白组合脱颖而出
231组蛋白组合中，仅三元组合表现出显著多能性维持能力，10种组合的NANOG表达量显著高于Matrigel（阈值：mean+3SD，图4C）。其中BIK（EphB4+DAG1+LN521）和GHK（EpCAM+BSG+LN521）效果最强，NANOG表达分别为Matrigel的2.18±0.32倍和2.00±0.22倍（图4B、D）；而单组分蛋白及二元组合均未达到阳性阈值，证明蛋白协同作用的重要性。
图4. 蛋白质初筛结果。A)筛查中使用的蛋白质及其相应字母代码的清单。B)显示在含有单一蛋白质和蛋白质组合的涂层上培养的HiPSC中NANOG表达的倍增变化的热图。每个独立阵列实验使用6个重复。将每个独立组的NANOG表达的平均荧光强度与在Matrigel(MG)涂层上培养的细胞的NANOG表达水平进行归一化(阳性对照)。绿色表示NANOG的高表达水平(自我更新能力较强)，红色表示与阳性对照(MG+)涂层上培养的细胞的标记表达水平相比，NANOG表达较低(自我更新能力较低)。C)在筛选中显示所有测试蛋白质组的相对NANOG表达的曲线图。蛋白质包被促进NANOG表达显著改变的阈值设为Mean+3SD。红柱表示阴性对照(无涂层，MG-)，绿柱表示阳性对照(MG涂层，MG+)，紫柱显示阳性hits。D)在初步筛查中确定的前十个阳性hits的列表。
03
验证：长期多能性维持与分化能力
长期培养：BIK和GHK涂层支持hiPSCs连续5代培养，细胞形态呈典型克隆状（图S10），NANOG、SOX2、OCT-4A的基因与蛋白表达水平与Matrigel无显著差异（图5B、C）；而对照组合DIK（E-Cadherin+DAG1+LN521）虽能促进细胞贴壁，但多能性标志物逐渐下调（图5B、C）。
三胚层分化：BIK和GHK培养的hiPSCs可形成类胚体（图2A），并成功分化为内胚层（FOXA2+）、中胚层（brachyury+）和外胚层（β-Tubulin3+），与Matrigel组分化能力一致（图2B），确认其多能性维持效果。
图5.蛋白质涂层对hiPSCs长期培养的影响：验证两种最有效的三元蛋白质组合(BIK和GHK)的效率。A)hPSCs在非涂层12孔板、Matrigel(MG)涂层12孔板以及DIK、BIK和GHK涂层12孔板上4天的集落附着效率。初步筛选发现BIK(EphB4+DAG1+LN 521)和GHK(EpCAM+BSG+LN 521)表达较强的NANOG，而以DIK(E-钙黏蛋白+DAG1+LN 521)蛋白培养的细胞NANOG表达较低。数据以平均值±3SD表示。(n=3)在MG、DIK、BIK和GHK涂层上培养的HiPSCs的图像，并对6种多功能标志物进行染色：Nanog、OCT-4A、SOX2(绿色荧光)；TRA-1-81、SSEA4、TRA-1-60(红色荧光)。比例尺：50μm。c)生长在MG、DIK、BIk和GHK包被的井板上的hiPSCs 5代(n=3，生物复制)的多能性标记基因(NANOG、OCT4和SOX2)的定量聚合酶链式反应分析。对照参考基因GAPDH对基因表达数据进行归一化。在培养在DiK、BIK和GHK涂层上的HiPSCs中，基因表达水平与生长在MG上的细胞的基因表达水平正常化。数据以均值 ±SEM（标准误）表示。**P <0.01和*P<0.001，MG组与Dik组之间有显著差异。
总结与讨论
该研究通过DMA平台实现了hiPSCs多能性维持蛋白组合的超微量高通量筛选，其核心突破在于：一是极致降本增效，仅用0.83 μg蛋白、2.8×10个细胞完成231组筛选，蛋白与细胞消耗分别仅为96孔板的1/860和1/25，大幅降低人源重组蛋白筛选成本并解决传统HTS的资源瓶颈；二是提供无动物源解决方案，筛选出的人源蛋白组合BIK（EphB4+DAG1+LN521）和GHK（EpCAM+BSG+LN521）无批次差异与临床应用限制，可替代Matrigel实现hiPSCs长期培养，为再生医学临床转化提供关键工具；三是凸显I.DOT非接触式纳升级移液系统的核心价值，其能精准打印60nL蛋白溶液与200 nL hiPSCs悬液，避免交叉污染与液滴蒸发，保障微量反应体系的稳定性与重复性，是DMA平台高效运行的关键支撑，未来该技术还可进一步拓展至其他稀缺细胞（如原代细胞）与昂贵分子的筛选，为干细胞生物学、药物发现等领域提供微型化 HTS新范式。