HRV-3C Protease简介
PreScission Protease是一种大肠杆菌中重组表达的带GST标签的人鼻病毒14型的3C蛋白酶(human rhinovirus (HRV) type 14 3C protease)，也称HRV 3C Protease或HRV3C Protease，能在低温条件下(4°C)特异性地识别八肽序列
Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro或核心五肽序列Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，并在Gln和Gly氨基酸残基之间进行酶切，常用于去除融合蛋白的Glutathione S-transferase (GST)、His或者其它标签的蛋白酶。
1 mg/ml 的 66 kD GST 融合蛋白 (1) 与 HRV 3C 蛋白酶以1: 100 (w/w) 的比例在裂解缓冲液中于 4°C 反应4 小时 (2) 和 3 天 ( 3）。切割产物为 40 kD 和26 kD。
HRV-3C蛋白酶反应条件：
10× 反应缓冲液：
500 mM Tris-HCl (pH 7.0)
1.5 M NaCl
10 mM EDTA
10 mM DTT
在常用的亲和层析洗脱缓冲液中的活性
常用亲和层析洗脱缓冲液组分
在常用盐或添加剂中的活性
在不同温度下活性
初始反应速度的温度依赖性。
MBP-NusG融合蛋白底物在指定温度下被 TEV [A] 或 R3C [B] 蛋白酶消化。在里面相应的插图（右），显示了未切割的代表性 SDS-PAGE 凝胶（泳道 1）和裂解（泳道 2-10；分别为 2、5、10、20、30、40、50、60 和 120 分钟）底物，在4°C时。
3C酶与TEV 处理肽底物的动力学参数
HRV-3C蛋白序列
氨基酸序列
>NP_740524(182aa)GPNTEFALSLLRKNIMTITTSKGEFTGLGIHDRVCVIPTHAQPGDDVLVNGQKIRVKDKYKLVDPENINLELTVLTLDRNEKFRDIRGFISEDLEGVDATLVVHSNNFTNTILEVGPVTMAGLINLSSTPTNRMIRYDYATKTGQCGGVLCATGKIFGIHVGGNGRQGFSAQLKKQYFVEKQ
>NT*-HRV-3C Protease
MHHHHHHSHTTPWTNPGLAENFMNSFMQGLSSMPGFTASQLDKMSTIAQSMVQSIQSLAAQGRTSPNDLQALNMAFASSMAEIAASEEGGGSLSTKTSSIASAMSNAFLQTTGVVNQPFINEITQLVSMFAQAGMNDVSAGNSGGGGSGPNTEFALSLLRKNIMTITTSKGEFTGLGIHDRVCVIPTHAQPGDDVLVNGQKIRVKDKYKLVDPENINLELTVLTLDRNEKFRDIRGFISEDLEGVDATLVVHSNNFTNTILEVGPVTMAGLINLSSTPTNRMIRYDYATKTGQCGGVLCATGKIFGIHVGGNGRQGFSAQLKKQYFVEKQ*
HRV-3C 表达
在1995年（G.M.Birch，1995）以及2011年Vanderbilt University大学结构生物学中心（未显示作者姓名）Protocol，均称HRV-3C 酶His标签版为包涵体表达。然而，我们的pET28a-HRV-3C质粒（表达His标签3C酶）于常规LB培养基中却可做到可溶性表达（个人数据，未公开）。
Leong（1992,1994,1999）系列文章中GST-3C蛋白酶为可溶表达，使用GST亲和填料与分子筛两步纯化。GST标签融合能促进3C蛋白酶的可溶性表达，产量为22mg/L（Antoniou，2017）。DsbA和MBP融合版3C蛋白酶也被成功制备，但为报道产量。
Abdelkader报道，使用蛛丝蛋白NT*融合表达，可实现超过300mg/L的表达量（Abdelkader，2020）。
Lee等(Lee,2020)报告一种在N端为7个Lys而C端6His标签的3C蛋白酶快速表达与纯化方法，该方案利用了MBP-融合表达，通过Ni亲和以及阳离子交换，可实现8小时完成整个纯化流程。
纯化HRV3蛋白酶的蛋白质构建体的示意图和氨基酸序列
SDS-PAGE结果:7Lys-MBP-HRV3C-6His的完整纯化过程。
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参考文献：
1.G.Antoniou,et al.Optimization of Soluble Expression and Purification of Recombinant Human Rhinovirus Type-14 3C Protease Using Statistically Designed Experiments: Isolation and Characterization of the Enzyme.Molecular biotechnology，2017 August11
2.L.Leong,et al.Efficient expression and purification of a Protease from the common cold virus,human rhinovirus type 14.Journal of Crystal Growth,1992(122):246-252
3.P.Walker,et al.Efficient and rapid affinity purification of proteins using recombinant fusion proteases.Nature Biotechnology,1994(12):601-605
4.L.Leong.The Use of Recombinant Fusion Proteases in the Affinity Purification of Recombinant Proteins.Molecular Biotechnology,1999(12):269
5.C.W.Lee,et al. Rapid purification of HRV3C and TEV proteases using polyhistidine and polylysine tags.BioDesign,2020(8):49-53
6.E.Abdelkader,G.Otting.NT HRV3CP: An optimized Construct of human rhinovirus 14 3C Protease for high yield expression and fast Affinity-tag Cleavage.Journal of Biotechnology. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2020.11.005
7.R.Ullah,et al.Activity of the Human Rhinovirus 3C Protease Studied in Various Buffers, Additives and Detergents Solutions for Recombinant Protein Production.Plos One,2016 April,19
8.S.Raran-Kurussi,et al.Differential Temperature Dependence of Tobacco Etch Virus and Rhinovirus 3C Proteases. Anal Biochem. 2013 May 15; 436(2): 142–144.